农业杆菌属是一类由H. J. Conn建立的革兰氏阴性细菌,它通过水平基因转移在植物中引起肿瘤。在这个属中,最常被研究的物种是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。农业杆菌因其能够在自身与植物之间转移DNA而闻名,因此它已成为遗传工程的重要工具。
命名历史
在1990年代之前,农业杆菌属被用作一个“垃圾箱”分类群。随着16S测序的出现,许多农业杆菌物种(尤其是海洋物种)被重新归入其他属,如Ahrensia、Pseudorhodobacter、Ruegeria和Stappia。剩余的农业杆菌物种被分为三个生物型:生物型1(Agrobacterium tumefaciens),生物型2(Agrobacterium rhizogenes)和生物型3(Agrobacterium vitis)。在21世纪初,农业杆菌属与根瘤菌属(Rhizobium)被合并为同属。这一举措证明是有争议的。当证明了农业杆菌属在系统发育上与根瘤菌属(Rhizobium)不同,并且农业杆菌物种通过一个独特的同源特征统一:即存在原端粒酶基因telA,导致属内所有成员都具有线性染色体外颗粒(chromid)时,这场辩论最终得到解决,农业杆菌属被重新确立。然而,到这个时候,三个农业杆菌生物型已经变得无效;生物型1保留在农业杆菌属中,生物型2被重命名为Rhizobium rhizogenes,生物型3被重命名为Allorhizobium vitis。
植物病原体
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)会引起植物的冠瘿病。这种疾病的特点是在感染的植物上形成类似肿瘤的生长或瘿瘤,通常发生在根和茎的连接处。肿瘤是由细菌的肿瘤诱导(Ti)质粒通过结合转移一个DNA片段(T-DNA)引起的。与之密切相关的物种,根瘤农杆菌(Agrobacterium rhizogenes),诱导根肿瘤,并携带不同的根诱导(Ri)质粒。尽管农业杆菌的分类目前正在进行修订,但可以概括地说,在这个属内存在3个生物型,即根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、根瘤农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)和葡萄园农杆菌(Agrobacterium vitis)。根癌农杆菌和根瘤农杆菌的菌株已知能够携带Ti或Ri质粒,而葡萄园农杆菌的菌株,通常局限于葡萄藤,可以携带Ti质粒。从环境样本中分离出的非农业杆菌菌株携带Ri质粒,而实验室研究表明,非农业杆菌菌株也可以携带Ti质粒。一些环境中的农业杆菌菌株既不携带Ti质粒也不携带Ri质粒。这些菌株是无毒的。
质粒的T-DNA半随机地整合到宿主细胞的基因组中,T-DNA上的肿瘤形态基因表达,导致瘿瘤的形成。T-DNA携带生物合成酶的基因,用于生产不寻常的氨基酸,通常是章鱼碱或诺帕碱。它还携带植物激素,[[吲哚乙酸(生长素,3-Indoleacetic acid)]]和[[0. 细胞分裂素(Cytokinins, CKs)]]的生物合成基因,以及生物合成 opines 的基因,为细菌提供碳和氮源,这是大多数其他微生物无法使用的,从而给农业杆菌带来了选择优势。通过改变植物细胞中的激素平衡,植物无法控制这些细胞的分裂,从而形成肿瘤。肿瘤基因产生的生长素与[[0. 细胞分裂素(Cytokinins, CKs)]]的比率决定了肿瘤的形态(类似根、无组织或类似茎)。
在人类中
尽管农业杆菌通常被视为植物的感染源,但它也可能导致免疫系统较弱的人类发生机会性感染,但并未显示出在健康个体中作为主要病原体。关于由放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)引起的人类疾病的最早关联是由苏格兰的J. R. Cain博士在1988年报告的。后来的一项研究表明,农业杆菌能够附着在几种类型的人类细胞上,并通过将其T-DNA整合到人类细胞基因组中,对这些细胞进行基因转化。这项研究是在培养的人类组织上进行的,并未对自然界中相关的生物活动得出任何结论。
在生物技术中的应用
农业杆菌将基因转移到植物和真菌的能力在生物技术中被利用,特别是在植物改良的遗传工程中。通过使用农业杆菌传递宿主在T-DNA二进制载体中的序列,可以工程化植物和真菌的基因组。可以使用修改过的Ti或Ri质粒。通过删除肿瘤诱导基因来“解除武装”质粒;T-DNA中唯一必要的是其两个小的(25碱基对)边界重复序列,至少需要一个进行植物转化。要引入植物的基因被克隆到一个含有解除武装质粒的T-DNA区域的植物二进制载体中,该载体还包含一个可选择的标记(如抗生素抗性),以选择成功转化的植物。转化后的植物在含有抗生素的培养基上生长,那些没有T-DNA整合到其基因组中的植物将会死亡。另一种方法是农杆菌介导的渗透。
通过农业杆菌进行转化可以通过多种方式实现。可以将原生质体或叶盘与农业杆菌一起孵化,并使用植物组织培养再生整个植物。在农杆菌介导的渗透中,可以将农业杆菌直接注射到植物叶片组织中。这种方法只转化与细菌直接接触的细胞,并导致质粒DNA的短暂表达。
农杆菌介导的渗透通常用于转化烟草(Nicotiana)。拟南芥的一种常见转化协议是花浸法:将一个花序浸入农业杆菌的悬浮液中,细菌转化产生雌配子的生殖细胞。然后可以筛选种子以获得抗生素抗性(或另一个感兴趣的标记)。当暴露于抗生素时,没有整合质粒DNA的植物将会死亡。
农业杆菌被列为以下美国转基因作物基因材料转移的载体:
• 大豆
• 棉花
• 玉米
• 甜菜
• 紫花苜蓿
• 小麦
• 油菜籽油(加拿大油菜)
• 匍匐剪股颖(用于动物饲料)
• 水稻(黄金大米)
使用农业杆菌转化真菌主要用于研究目的,并且遵循与植物转化类似的方法。Ti质粒系统被修改,包括用于选择转化真菌菌株的DNA元件,在携带这些质粒的农业杆菌菌株与真菌物种共同培养后进行选择。
基因组学
对几种农业杆菌物种的基因组进行测序,使得研究这些生物的进化历史成为可能,并提供了关于参与病理发生、生物控制和共生的基因和系统的信息。一个重要的发现是,许多这些细菌的染色体可能正在从质粒进化而来。另一个发现是,这个群体中多样的染色体结构似乎能够支持共生和病原生活方式。随着农业杆菌物种的基因组序列的可用性不断增加,我们将对这一类植物相关微生物的功能和进化历史有更深入的了解。
历史 根特大学(比利时)的马克·范·蒙特古(Marc Van Montagu)和约瑟夫·谢尔(Jozef Schell)发现了农业杆菌和植物之间的基因转移机制,这导致了改变农业杆菌成为植物基因工程中高效传递系统的方法的开发。由玛丽-戴尔·奇尔顿(Mary-Dell Chilton)领导的研究团队是最先证明可以移除毒性基因而不会不利影响农业杆菌将其自身DNA插入植物基因组的能力(1983年)。