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学而记

百科词条

存在问题及展望

目前,水产动物类胡萝卜素吸收、转化和沉积机制研究尚处于模仿模式动物机制阶段,研究内容大多为克隆和鉴定模式动物的同源基因,鲜有系统的机制阐述和功能基因验证,极少有新基因报道,研究创新性不足。水产动物类胡萝卜素吸收、转化和沉积机制需要采用新方法突破水生环境对研究的限制,充分利用水产动物具有丰富体色突变体的特点开展研究。 类胡萝卜素吸收保守性较强,基于同源分子的序列保守性,大部分水产动物的同源分子序

目前,水产动物类胡萝卜素吸收、转化和沉积机制研究尚处于模仿模式动物机制阶段,研究内容大多为克隆和鉴定模式动物的同源基因,鲜有系统的机制阐述和功能基因验证,极少有新基因报道,研究创新性不足。水产动物类胡萝卜素吸收、转化和沉积机制需要采用新方法突破水生环境对研究的限制,充分利用水产动物具有丰富体色突变体的特点开展研究。

基于基因-表型关联分析研究胡萝卜素的吸收、代谢机制

类胡萝卜素吸收保守性较强,基于同源分子的序列保守性,大部分水产动物的同源分子序列都已获得,基本有mRNA表达的数据。水产动物摄入类胡萝卜素的种类和数量受环境影响较大,且难以有效控制;吸收类胡萝卜素的分子功能鉴定较困难,基因与类胡萝卜素吸收种类和数量之间的因果关系几乎无法建立。哺乳类的全基因组关联研究(GWAS)和候选基因关联研究已确定SR-B1和CD36的SNP位点与类胡萝卜素血液浓度间的相关性。笔者也发现,ABCG2的SNP位点与米虾体色、类胡萝卜素含量存在关联。这些研究提示,基因与表型关联分析是研究水产动物类胡萝卜素吸收、代谢机制的有效途径,而且可为富含类胡萝卜素的良种选育提供遗传数据。

基于多组学联合技术筛选鉴定新的酮化酶基因

在类胡萝卜素吸收、代谢和沉积的研究中,筛选和验证类胡萝卜素转化基因的难度最大。类胡萝卜素转化的中间产物含量低、测定难是主要的限制因素,因此,能鉴定出来的类胡萝卜素转化酶数量较少,主要集中在裂解酶BCO1和BCO2上。目前,水产动物基因敲除手段已初步开始应用,为关键基因的验证提供了一个新选择,也是分析因果关系的一个有效手段。经典方法是根据类胡萝卜素种类和数量推断催化机制来确定酮化酶种类,该方法能够发现新的酮化酶,但工作量巨大且催化中间产物难以测定,较少在水产动物中开展。酮化酶的催化机制是保守的,其催化功能域在序列上也具有保守性,水产动物酮化酶的获得主要通过序列同源比对来实现,随着代谢组、转录组技术的进步,三者数据的结合为发现水产动物新的酮化酶提供了便利。

基于单细胞转录组技术解析类胡萝卜素的沉积过程

类胡萝卜素只有与CBP(carotenoid-binding protein)结合后才能在细胞或组织中大量沉积。许多水产动物的CBP能够改变类胡萝卜素的吸收波峰,产生非常多样的颜色,这为CBP的分离纯化提供了便利。蛋白分离纯化是获得CBP的主要途径,但由于工作量大、效率低下,目前,在水产动物中还缺少这方面的研究。

水产动物色素细胞种类多样,大多数色素细胞只含有一类色素,其色素体结构形态与色素种类密切相关。大多数红色素和黄色素细胞都含有类胡萝卜素,色素细胞的色素体是类胡萝卜素沉积的主要靶点,也是发现新CBP的主要研究对象。目前,对脊椎动物黑色体的形成过程已研究得较为清楚,而对其他色素体的研究尚处于空白,这极大地限制了对类胡萝卜素沉积过程的研究。近期兴起的单细胞转录组和空间转录组技术有望能为研究色素体的发生过程和蛋白组成提供解决方案。单细胞转录能检测单个色素细胞的转录子,高效鉴别不同种类的CBP和类胡萝卜素转化酶,获得造成色素细胞色素差异的关键基因;同时,比较不同发生阶段色素细胞的单细胞转录组能够解析色素体发生的过程。这两个方面都能极大地促进类胡萝卜素沉积过程的研究。由于大部分色素细胞直径大于40 μm,超过了单细胞转录组测序的要求,在进行测序细胞制备时可采用药物或激素方法使色素细胞聚集收缩,以满足测序组的要求。单细胞测序平台本身可通过提取细胞核的手段解决大细胞测序困境。色素细胞较大的体积在进行空间转录组测序时则成为一个有利条件,较大细胞能承载更多的测序位点,RNA区分度增加,利于RNA的组织定位。空间转录组和单细胞转录组数据能够相互验证,这两种方法是解析色素合成和沉积的有力工具。

筛选和构建水产动物体色遗传材料

比较不同体色水产动物转录组或比较表皮有色部分和无色部分转录组,会获得大量差异基因,而多数差异基因与色素吸收、转运和代谢无直接关系,反而与细胞外基质、微丝微管、色素颗粒移动、脂质与糖代谢、蛋白折叠和降解等具有紧密关系。这表明天然体色突变体材料遗传背景相对复杂,需要在构建纯系和杂交家系等材料的基础上进行遗传分析以确定体色性状的遗传基础,这样才能发现关键差异基因。虾夷扇贝闭壳肌颜色性状的QTL定位就是一个成功的例子,其体色表型容易识别且具有较高的遗传相关性,容易构建纯系和杂交家系等遗传材料。因此,构建遗传材料对于解析各种体色变异及体色形成机制具有重要意义。

水产动物大多能繁殖大量后代,具有较高的突变率,因此,天然存在大量的突变体。但目前灵活高效且成本较低的基因分型手段缺乏,限制了水产动物体色突变体的遗传筛查。GT-Seq(Genotyping-in-thousands by sequencing)是一种靶向基因重测序技术,其原理是在利用PCR靶向扩增目的DNA片段的同时,添加能够标识个体信息的Barcode,再利用二代测序高通量的特点实现SNP或SSR的高通量低成本分型。因其检测位点可以自主设计和自由组合,故较适合进行水产动物体色候选基因的分型。在用GT-Seq对大量水产动物突变体进行基因分型基础上,快速建立体色纯系,非常利于体色关键基因的鉴定。

动物类胡萝卜素吸收、转运和代谢的基本规律在不同类群间保守性较高,高通量测序数据提供了大量的候选基因。筛选和鉴定具体体色突变体形成的关键基因是未来研究的重点和难点,单细胞测序、突变体的遗传筛选和体色遗传材料的构建是解决这一问题的重要途径。总之,众多关键基因的解析必将丰富和完善动物类胡萝卜素的利用机制,加深对动物体色在生理、生态、遗传和进化等方面的认识。